A Glasgow közeli Blantyre-ben született 1813. március 19-én, szegény munkásszülők hét gyermeke közül másodikként. Már tízéves korától egész nap a pamutfonóban dolgozott, de hajtotta a tudásvágy. Első keresetéből latin nyelvkönyvet vett, esti iskolába járt, majd a mélységesen vallásos Livingstone úgy döntött, hogy orvos-misszionárius lesz. 1836-tól a glasgow-i egyetemen munka mellett görögöt, teológiát és orvostant hallgatott, 1840-ben Londonban szerzett orvosi oklevelet.
Első hittérítő útjára 1840 végén indult. Eredetileg Kínába készült, de az ópiumháború miatt végül Dél-Afrika mellett döntött. 1841 tavaszán érkezett Fokvárosba, ahonnan az angol kolóniától északra fekvő, feltáratlan vidékre indult. Megismerte a helyi nyelveket és szokásokat, és messzebb hatolt be a Kalahári-medencébe, mint előtte bármelyik európai felfedező.
1843-ban oroszlántámadás érte, ami azonban nem szegte kedvét, bár bal karján maradandó sérülést szenvedett. Livingstone nem tartozott a hagyományos hittérítők közé: az a meggyőződés hajtotta, hogy az ő feladata megtalálni az utat a kontinens szívébe, amelyet azután a misszionáriusok és kereskedők használhatnak, megingatva a rabszolga-kereskedelmet. Az afrikaiakat magával egyenlőknek tekintette, iparra és földművelésre próbálta őket tanítani. Harminc évet töltött Afrikában, és a becslések szerint haláláig összesen mintegy 46 ezer kilométert tett meg, mindezt főként gyalog.