Színész apja Amerika több városában és társulatában próbált szerencsét. Útjaira felesége is elkísérte, három fiuk három különböző városban született, Eugene egy New York-i hotelszobában látta meg a napvilágot 1888. október 16-án. A házaspár másodszülött fia kétéves korában meghalt, az asszony ettől kezdve morfiumfüggő lett, a szertől csak halála előtt néhány évvel sikerült megszabadulnia. Eugene gyerekkorát beárnyékolta anyja betegsége; hétéves korától egy bentlakásos katolikus iskolába küldték. Jóllehet kitűnő tanuló volt, folyamatosan lázadt a szigorú szabályok ellen, elszigeteltségében csak az olvasásban talált örömet.
1906-ban beiratkozott a Princeton Egyetemre, de magaviselete miatt egy év után eltanácsolták az intézményből. Ezt követően különböző munkákat vállalt, volt aranyásó, (aranyat ugyan nem talált, de maláriás lett), matróz, újságíró egy kisvárosi lapnál, egy utazó színház segédrendezője, rövid ideig színész is, de – ahogy egy önvallomásában írta – vagy gyorsan kirúgták, vagy ő volt az, aki sietve továbbállt.
Kezdődő tuberkulózisa miatt 1912-ben fél évre szanatóriumba vonult. A kezelés ideje alatt sokat olvasott, főleg Ibsen, Wedekind és Strindberg műveit, ekkor kezdett írni is. 1914-ben beiratkozott a Harvard Egyetemre, ahol a híres George Pierce Baker drámaíró-szemináriumait látogatta, de egy év után újfent megszakította tanulmányait. Massachusettsben csatlakozott a fiatal írók és festők, valamint lelkes amatőrök Provincetown Players elnevezésű kísérleti színházi csapatához, amelynek egyfelvonásos darabokat kezdett írni. Hamarosan ő lett a társulat házi szerzője. A csapat 1916 és 1923 között New Yorkban működött, és O’Neill nevét hamar megismerte a közönség. Első egész estés drámáját, a Beyond the Horizon (Túl a horizonton) című színművet 1920-ban mutatták be a Broadwayn, és rögtön el is nyerte a Pulitzer-díjat, amelyet a szerző később még három alkalommal kapott meg.