Egy Illinois állambeli kisvárosban született – apai ágon horvát, anyai ágon francia, német, skót és angol vér csörgedezik az ereiben. Tizenévesen folkzenét játszott, tagja volt az iskolai focicsapatnak, végül a színház mellett kötelezte el magát. Egyetemistaként Chicagóban színházat alapított Steppenwolf Theatre néven; a társulatnak színésze, rendezője és díszlettervezője is volt, és itt ismerte meg későbbi feleségét. Hamarosan az off-Broadway színházaiban léphetett fel, harmincéves korában megkapta az Obie-díjat, 1985-ben pedig a tévés szakma legnagyobb kitüntetését, az Emmy-díjat vehette át Az ügynök halála című Arthur Miller-dráma televíziós változatáért.
Első jelentős filmszerepét 1984-ben a Hely a szívemben című drámában kapta, amiért rögtön Oscar-díjra jelölték. Ugyanebben az évben szerepelt a Gyilkos mezők című, a vörös khmerek Kambodzsájában játszódó filmben. Első főszerepét 1987-ben Steven Spielberg A nap birodalma című háborús filmdrámájában kapta. A nagy áttörést a következő évben a Stephen Frears rendezte Veszedelmes viszonyok hozta meg számára, ebben az intrikus és cinikus nőcsábász Valmont grófot alakította. Malkovich és a női főszereplő, Michelle Pfeiffer között a valóságban is viszony szövődött, amelyre a színésznek ráment a házassága. Magánéleti válságából a Bernardo Bertolucci rendezte Oltalmazó ég húzta ki: a forgatáson ismerkedett meg második feleségével, akivel immár több mint három évtizede élnek együtt.
A kaméleonnak tartott, sokarcú Malkovich a legkülönfélébb karaktereket öltötte már magára. Leghitelesebb alakításai sokak szerint az „ördögi”, különlegesen neurotikus és megszállott figurák. Volt már szellemileg visszamaradt vándormunkás (Egerek és emberek), az amerikai elnök életére törő pszichotikus bérgyilkos (Célkeresztben – ezért kapta második Oscar-jelölését), egyszerre Dr. Jekyll és Mr. Hyde (A gonosz csábítása). Megszemélyesítette a filmrendező Michelangelo Antonionit (Túl a felhőkön), a festőművész Gustav Klimtet (Klimt), a diplomata Talleyrand-t (a Napóleon című tévésorozatban) és VII. Károly francia királyt (Szent Johanna) is. Szerepelt kosztümös kalandfilmben (A vasálarcos), akciófilmben (Con Air – A fegyencjárat), társadalmi drámában (Elcserélt életek), volt CIA-ügynök (Égető bizonyíték), és játszott vígjátékban (Kubrick menet). Igazi különlegességnek számít a A John Malkovich-menet című szürreális alkotás, amelynek szereplői Malkovich agyában találják magukat (a saját magát alakító színész a filmért elnyerte a New York-i Filmkritikusok díját). A Transformers-akciósorozat harmadik része, illetve a Red és a Red 2 kedvéért a könnyedebb filmes műfajok területére is elkalandozott.